在前面的文章中伯小远给大家介绍过ChIP-seq以及ATAC-seq的实验原理、过程及应用，同时引入了很多表观遗传学的基础知识（解析表观遗传学的工具——ChIP-seq（一），解析表观遗传学的工具——ChIP-seq（二），解析表观遗传学的工具——ATAC-seq（一），解析表观遗传学的工具——ATAC-seq（二））。通过阅读以上文章，相信我们大家对表观遗传学相关的基础知识及其解析工具都有了一定的了解吧。而在2019年，一种比ChIP-seq更简便快捷的解析表观遗传学的工具——CUT&Tag首次出现，那CUT&Tag究竟是什么？有着怎样的优势呢？下面就跟着伯小远一探究竟吧！
组蛋白翻译后修饰和转录因子在染色质上的结合在基因转录调控中发挥着重要的作用，因此，表征全基因组组蛋白的修饰位点和转录因子的结合位点对于阐明它们的转录调控功能至关重要。CUT&Tag是Cleavage Under Targets and Tagmentation（靶向剪切及标签技术）的缩写，可拿来研究组蛋白修饰以及蛋白质与DNA之间的相互作用，该技术利用Tn5转座酶的特点，在切割染色质的同时直接插入接头（adaptor），极大地缩减了建库时间，且对样本量的要求更低，所需的测序深度也更低 (Kaya-Okur et al., 2019)。
CUT&Tag技术的核心是pAG-Tn5融合蛋白（ChiTag），其中Protein A/G能够结合抗体。在进行CUT&Tag实验时，首先将细胞与磁珠混合，接着进行靶蛋白特异性抗体（一抗）孵育，使抗体进入细胞与靶蛋白结合。为了放大信号，接着进行二抗孵育。最后孵育pAG-Tn5转座体，使得转座体进入细胞并与抗体结合，这样就把转座体间接的固定在靶蛋白上，随后加入Mg2+，激活Tn5酶的切割活性，打断靶蛋白结合的DNA区域。由于Tn5酶连有测序接头，在打断的同时直接在片段化的DNA上加接头，接着提取DNA，进行PCR扩增构建文库（图1）。其主要的实验流程如下：
（1）提取细胞核并与磁珠结合：CUT&Tag通常使用未固定的新鲜样本作为起始材料，也能够正常的使用冷冻样本，还可使用提取细胞核后经轻微固定的样本。完成细胞核的提取后，将细胞核与伴刀豆球蛋白A磁珠（ConA beads）结合，ConA磁珠能与细胞膜上的糖蛋白结合，从而吸附在细胞上，提高对细胞实验操作的效率，减少在后续实验过程中的细胞损失。结合后使用洋地黄皂苷（digitonin）透化细胞膜（原理是与胆固醇分子结合），为抗体等的进入提供可能性。
（2）一抗、二抗结合：一抗是针对靶蛋白所设计的特异性抗体，同时需加入阳性（α-H3K27me3）和阴性对照（同型对照IgG）样本。一抗孵育后，用含洋地黄皂苷的洗涤缓冲液快速洗涤，然后将细胞核与二抗一起孵育。
（3）ChiTag转座体结合抗体：通常用Protein A/G-Tn5体系来实现Tn5转座酶的结合，Protein A/G对于IgG的Fc段具备极高的亲和性，常常被应用于IgG抗体的纯化，所以使用Protein A/G就能把Tn5转座酶带到IgG二抗结合的基因组位点。关于Tn5转座酶识别染色质可及性的机制，小远在这里就不过多介绍啦，感兴趣的朋友可以去阅读之前的文章“解析表观遗传学的工具——ATAC-seq（一）”哟。
（4）Tn5转座酶激活与片段化：通过添加含有Mg2+的反应液使Tn5转座酶开始发挥作用，在打断靶蛋白结合的DNA区域的同时将携带的建库接头连接到DNA片段上。
（5）测序文库构建与高通量测序：提取DNA，进行PCR扩增构建文库，进行高通量测序。
（6）数据分析：包括原始数据质控、参考基因组比对、Peak基因注释、峰图分析及注释、Motif分析、GO注释分析、KEGG注释分析等。
作为表观遗传学领域的研究热点，DNA-蛋白质互作最常用的技术为ChIP-seq，然而ChIP-seq技术存在样本量大、信噪比低、背景信号强和分辨率低等缺陷。目前已有多篇文献对CUT&Tag技术和ChIP-seq技术进行了详细的对比性实验，验证了CUT&Tag技术的优势及准确性。接下来小远给大家介绍一篇文献，便于大家对CUT&Tag技术有一个详细和深入的了解。
图2 CUT&Tag与ChIP的实验流程 (Tao et al., 2020)。作者比较了CUT&Tag与ChIP的实验流程，发现CUT&Tag实验操作的流程中不有必要进行实验材料的交联和DNA超声处理，通过Tn5将结合蛋白的染色质片段破碎后，片段就已经与接头整合，可以直接进行PCR富集和NGS，总之CUT&Tag在操作简便性和所需的实验时间方面优于ChIP。
伯小远将与ChIP-seq相比CUT&Tag存在的优势总结如下（表1）。
2019年Kaya-Okur等人首先在哺乳动物中使用CUT&Tag技术提供了高分辨率测序来分析不同的染色质组分，通过在低样本量和单细胞水平分析组蛋白修饰、RNA聚合酶II和转录因子的表达证明了CUT&Tag技术的实用性 (Kaya-Okur et al., 2019)。这是首次运用CUT&Tag技术进行动物细胞组蛋白修饰及转录因子结合位点的研究。然而由于植物细胞存在细胞壁、大液泡及一些次生代谢产物，使得CUT&Tag技术在植物中的应用具有挑战性，但是目前已有一些研究表明CUT&Tag技术能够成功运用到植物细胞中，下面让我们一起看看CUT&Tag技术在植物细胞中的应用吧！
图7 snCUT&Tag解析水稻组蛋白修饰 (Ouyang et al., 2022)。snCUT&Tag的实验流程：收集大约106个细胞核，使用protein G-Tn5进行免疫切割，再将约20000个经过切割的细胞核送入10×的微流控系统，按照单细胞ATAC文库的构建流程建库，最后进行测序（a）。作者首先使用snCUT&Tag分析了明恢63水稻种子的H3K4me3组蛋白修饰位点，将snCUT&Tag数据与多细胞核CUT&Tag和eChIP-seq数据作比较，发现snCUT&Tag是一种可拿来描绘单个细胞核染色质特征的可靠方法（b-f），随后作者利用H3K4me3 snCUT&Tag数据预测了细胞类型特异的染色质互作，通过降维和聚类将水稻幼苗中的细胞分为17个亚群（g），联合H3K4me3 ChIA-PET数据，发现snCUT&Tag的数据同ChIA-PET一致性较好（h），有51.5%的预测增强子与snCUT&Tag的峰重叠（i），表明snCUT&Tag信号在预测增强子中心附近显著富集（j、k）。
图8 应用B-CUT&Tag鉴定拟南芥AtSPL9的靶基因 (Tao et al., 2023)。作者比较了B-CUT&Tag和ChIP的实验流程，发现B-CUT&Tag优于ChIP（a），AtSPL9 B-CUT&Tag信号主要分布在转录起始位点（TSS）上游，即启动子区域（b），AtSPL9 B-CUT&Tag两个技术重复显示出高度相关性（c），并分别获得了9290和9188个结合峰，其中6383个峰（约70%）是重叠的（d），使用14天幼苗的嫩枝进行ChIP和使用28天植株的花序和21天植株的嫩枝进行B-CUT&Tag所重叠的AtSPL9的潜在靶基因（e），最后作者绘制了AtSPL9的调控网络图，AtSPL9的靶基因包括幼年向成年转化/开花、腺毛发育、类黄酮生物合成、蜡质合成和分枝等相关的基因（f）。
图9 异源过表达GhLYI会诱导拟南芥叶片提前衰老 (Zhang et al., 2023)。作者在拟南芥中异源表达GhLYI，获得了两个过表达株系JK-9和JK-11，并且发现在长日照（A）、短日照（B）、黑暗处理（C）条件下，与野生型相比，两个超表达株系均表现出早衰表型，DAB染色（D）和NBT测定（E）根据结果得出黑暗会促进GhLYI介导的叶片衰老过程中H2O2和O2-的累积。接下来作者研究了不同年龄段单叶衰老的特征发现JK-9和JK-11株系叶片提前黄化衰老（F），随后测定叶片叶绿素含量发现JK-9和JK-11株系叶片叶绿素含量下降得更快、更明显（G），GhLYI和衰老诱导基因SAG12的表达量也相比来说较高（H、I），以上根据结果得出GhLYI是叶片衰老的正向调节因子。
图10 全基因组范围内GhLYI结合位点的鉴定 (Zhang et al., 2023)。为了确定GhLYI的全基因组结合位点，作者利用转基因拟南芥进行CUT&Tag实验，使用GFP抗体从叶片组织中提取与GhLYl结合的DNA，提取植物细胞核后，用DAPI染色检测细胞核的质量，经过测序，作者成功地在三个生物重复中分别获得了139、38和138个结合峰，并且这些结合峰拥有非常良好的重复性（A），样本1和样本2的峰值主要位于转录起始位点上游1000bp范围内（B），为了确定GhLYl的结合基序，作者利用MEME-ChIP工具鉴定出GhLY1结合的唯一富集基序为ACACGTG（C），随后作者使用FLAG抗体对转基因GhLYlox棉花进行了CUT&Tag检测，以确定GhLYI的体内结合位点，维恩图显示了三个重复中重叠的基因，共有489个（D），并且大约17%的峰值位于基因转录起始位点5处2000bp序列范围内（E），使用MEME-ChlP对峰值序列做多元化的分析发现了两个结合序列CACGTG和GGT/CCC（F），并对GhLYI结合基因进行了KEGG富集通路分析（G）。
利用CUT&Tag进行转录因子结合位点鉴定时需要获得稳定的转基因材料，而获得稳定的转基因材料往往是费时的，因此基于原生质体体系的CUT&Tag技术应运而生（pCUT&Tag/tsCUT&Tag），下面小远将利用两篇文献为我们讲述解答基于原生质体体系的CUT&Tag技术。
图13 tsCUT&Tag解析植物中的转录因子结合位点 (Wu et al., 2022)。tsCUT&Tag技术流程如下：先从特定组织中分离植物原生质体，例如玉米黄化苗和水稻绿叶鞘等。将转录因子克隆到pM999-GFP载体中，在分离的原生质体中瞬时表达。收集大约105个成功转染的活细胞，立即固定在ConA Beads上，并用5% Digitonin（洋地黄皂苷）预处理细胞以结合一抗和二抗以及pG-Tn5转座酶，最后，基于Tn5转座酶酶切和PCR扩增构建转录因子结合DNA文库（A）。为了评估tsCUT&Tag数据的有效性，作者将检测ZmKNOX6结合位点的tsCUT&Tag数据与已发表的提取细胞核的tChIP-seq数据作比较，发现tsCUT&Tag实验的背景相比来说较低，并且tsCUT&Tag和tChIP-seq之间的数据高度相关（B），与tChIP-seq相比，tsCUT&Tag的FRiP（峰值读数分数）明显更高（C），此外，利用tsCUT&Tag和tChIP-seq鉴定的ZmKNOX6靶基因重叠率很高（D）。随后，作者对检测玉米中TB1和水稻中IPA1结合位点的tsCUT&Tag数据和传统的ChIP-seq数据作比较，TB1和IPA1的ChIP-seq和tsCUT&Tag数据表现出高度相关性，在ChIP-seq中鉴定了超过50%的TB1和IPA1的tsCUT&Tag靶向基因（E），从tsCUT&Tag鉴定到的TB1和IPA1基序与ChIP-seq相似（F），与ChIP-seq峰值信号相比，TB1和IPA1的tsCUT&Tag在转录起始位点附近具有非常明显更高的信号（G），尤其是在几个已知的靶基因中（H），tsCUT&Tag的FRiP在TB1和IPA1中都远高于ChIP-seq，表明tsCUT&Tag的信噪比高（I）。
图14 基于8个转录因子的tsCUT&Tag数据构建出了玉米花序的转录调控网络 (Dong et al., 2023)。作者为了评估tsCUT&Tag数据的质量，将tsCUT&Tag数据与ChIP-seq数据、ATAC-seq数据作比较，发现tsCUT&Tag能有效地绘制高质量的TF结合图谱（a、b、c），接着作者选定了8个在玉米花序发育中起作用或在花序中高表达的转录因子（d），并进行了tsCUT&Tag实验，每个转录因子都有两个生物重复，其皮尔逊相关系数在0.90到0.97之间（e），每个转录因子鉴定出了4530至18684个高置信度的结合位点（f），41%至60%的结合位点位于启动子区域（g），并且发现TFBSs（转录因子结合位点）和OCRs（开放染色质区域）具有高度一致性（h），最后作者构建了基于4个WOX转录因子tsCUT&Tag数据的调控网络（j）和基于tsCUT&Tag数据预测的IFA1和MADS-box转录因子调控网络（o）。
本篇文章到此就告一段落了，简单回顾一下今天的内容。小远主要给大家介绍了什么是CUT&Tag、CUT&Tag的实验原理与流程、CUT&Tag的优势，并通过文献案例分享了CUT&Tag在植物上的应用以及基于原生质体的CUT&Tag技术。通过文献我们得知与ChIP-seq相比，CUT&Tag技术在植物中也表现出快速高效、更高分辨率和更低背景信号的优势，相信CUT&Tag技术在植物上的运用会越来越成熟。由于篇幅有限，小远在这里展示的CUT&Tag在植物上的应用案例并不多，你们可以查阅更多的文献去了解CUT&Tag技术哟！
